使用化学探针 - 简介
在同行评审文献中，实验的可复现性一向是讨论热点，因此，我们必须更加谨慎地审查和选择在研究中使用的工具。选择“优秀的”探针是获得可靠、可复现数据的关键。我们 SGC 的使命之一，就是向研究人员提供这些探针。
“化学探针”是一些经过良好表征的小分子，可高效选择性的作用于靶标蛋白，精确引发细胞内作用。借助化学探针，可在细胞分析中建立靶标蛋白的抑制或激活与表型的联系。
我们制定了一系列化学探针标准，用于定义可接受的质量标准，以及区分它们不同的功能。SGC 要求，一种化合物需要满足以下标准（表 1），才可正式被归类为表观遗传学探针。
| 标准 | 表观遗传学探针 |
|---|---|
| 体外效价（IC50 或 Kd） | < 100 nM |
| 家族选择性 | > 30 倍 |
| 细胞活性（IC50 或 EC50） | 1 μM 浓度下具有显著靶向活性 |
表 1. 表观遗传学靶标家族蛋白化学探针标准。
以下博文旨在提供简要介绍和指南，帮助研究人员选择和使用化学探针。
选择化学探针
首先，我们推荐使用网络化学探针数据库进行搜索，例如 Chemical Probes Portal (CPP)、Probe Miner (PM)、Guide to Pharmacology 和 Probes and Drugs。研究人员可以在这些网站针对靶标进行搜索，以查找关于靶标可用探针的详细信息。我们建议，在最终选择之前，再使用 PubMed 进行一次搜索。
图 1. 选择化学探针的工作流程。
检查清单
- PubMed 上关于探针的近期数据是否会影响到您的选择？例如细胞毒性或脱靶效应。
- 探针是否可通过商业渠道购买？
- 探针是否具有可通过商业渠道购买的对照物？
- 是否存在不同化学型和/或作用模式的正交探针可用作额外对照？
质量控制
- 商业供应商（在化学探针数据库中列出）会为每个批次的化合物提供一份分析证书 (CofA)。确保从有信誉的供应商处购买，检查 CofA，确认化学和手性（如适用）纯度符合标准。
- 化学探针必须进行正确的存储和处理，对于每种探针，查看并遵循供应商的存储和溶解性指南。一般来说，建议在 -20°C 以固体形式存储化合物，长期存储则为 -80°C。准备使用时，在适当的溶剂中制备储备液（SGC 通常在二甲基亚砜 (DMSO) 中制备成 20-30 mM 浓度，但对于每种探针，请首先查看供应商提供的溶解性数据），然后等分为合适的体积以用于分析。（为方便起见，可使用 Tocris 摩尔浓度、稀释或重溶计算器）
- 制备完成后，储备液最好应按份装入密封玻璃瓶，存储于 -20°C 或更低温度，每份储备液最多经历一次冻结解冻循环，并应在 1 个月内使用。溶液应尽量当天制备、当天使用。
- 建议您在进行日常使用前，首先进行一次体外或细胞实验来检查探针（以及在相关情况下的对照物）是否按预期发挥作用。
使用化学探针
首先考虑在分析中使用的合适浓度；此处的关键因素包括探针的效用和选择性特征。
- 请注意，任何化学探针的细胞效用都可能因细胞谱系和传代次数而发生变化。如果可能，建议研究人员首先使用目标细胞谱系进行量效实验，根据实验结果选择合适的浓度。
- 了解探针的选择性特征，识别实验中的重要反靶标。使用适当的浓度，避免已知的脱靶效应，并了解这些已知（或可能未知）效应的含义。
- 同样应考虑预期表型效应的时间要求，进行相应的实验设计来获取相关的效应。例如，布罗莫结构域拮抗剂通常会在数小时内作用于表型，甲基转移酶抑制剂则需要数天对表观遗传学标记物发生作用，并需要一周或更久才能引发表型反应。
化合物库筛选建议
- 筛选较大的化合物库时，SGC 建议一般应使用不显著超出每种探针已发表 IC90 的浓度。
- 在筛选时，识别最初的“活性化合物”，然后使用一系列不同浓度重复分析过程，浓度变化应围绕每个单独的 IC50/EC50，变化幅度至少为两个数量级。
- 尽可能包括非活性对照化合物，也可考虑使用阳性或正交对照物。这些正交探针可以属于不同的化学型，和/或通过不同的机制发生作用。如果使用正交探针得到了相似的表型反应，即同向效应，则对靶标的抑制就更可能是观察到的表型的原因。如果没有发生同向效应，则有可能是其中一种探针存在干扰性的脱靶或毒性效应。
评估结果：初级和次级细胞反应
对初级（生化）与功能和/或表型（次级）实验进行量效比较，可在靶标和表型之间建立因果关系。初级反应通常可通过生物标记物监控（例如，探针可以抑制某种酶，而这种酶会导致组蛋白甲基标记物沉积，通过检测该标记物的细胞水平即可了解反应情况）。次级反应的解析较为复杂，因为通常会通过细胞活力显示。在化学探针的 IC90 浓度，靶标预计会被抑制 90%（根据生物标记物测量得出）。如果 IC90 以下的浓度没有对细胞活力产生影响，则探针可能已经作用于靶标（可通过靶标的基因抑制进行确认）。但是，如果在浓度远低于 IC90 时出现细胞死亡，则探针对细胞活力的效应很可能是通过了某种脱靶机制。
细胞活力曲线的形状也可揭示脱靶效应。过于陡峻或浅平的斜率已被发现与多重药理、群落响应异质性或非特异性毒性相关。此外，在高化合物浓度时可能发生显著的功能性效应（相比生物标记物效应而言）。在这种情况下，建议使用两种阳性对照物（具有不同的化学型）以了解药理。
关于如何使用 SGC 化学探针的综述，请点击这里。
SGC 表观遗传学化学探针的影响
SGC 致力于推动人体生物学和药物研发新领域的研究。为此，SGC 专注于人类基因组中那些研究较少的领域，例如表观遗传学靶标。SGC 将经过良好表征的化学探针提供给研究人员，在全球范围内促成了大量研究成果的涌现。衡量 SGC 表观遗传学化学探针影响的一个方式，是评估相关的引用数。下方按靶标类别和部分探针汇总了这一信息（图 2）。BET 家族、G9a/GLP 甲基转移酶和 JMJD3/UTX/JARID1B 脱甲基酶化学探针的科研影响是非常显著的，表明研究人员对这几类关键靶标具有浓厚而持续的兴趣。
图 2：顶 - 每种探针按靶标类别汇总的引用数。底 - 自首篇探针发表以来的引用数。注意，BET 布罗莫结构域化学探针 (+)-JQ1 (2010) 和 PFI-1 (2013) 未包含在直方图中。这两种化学探针的总引用数为 1945 次，其中 (+)-JQ1 为 1799 次。
同类首创化学探针
SGC 开发了多种同类首创化学探针：GSK-J4，用于 JMJD3/UTX/JARID1B；SGC-CBP30 和 I-CBP112，用于 CBP/p300 的布罗莫结构域；LP99，用于 BRD9 和 BRD7；OF-1，用于 BRPF1/2/3；PFI-4，用于 BRPF1B；以及 OICR-9429，用于 WDR5 的甲基赖氨酸结合结构域。此外，通过 SGC 的捐赠探针计划，AbbVie 捐赠了首个高效、选择性的乙酰基转移酶化学探针 A-485，用于 CBP/p300。学术界和工业界的科学家共同努力，不断提供同类最佳的化学探针。对于这些靶标，现在已经有了更为先进的化学探针（就靶向效用和/或具有化学型匹配对照物而言）。例如：BI-9564 和 TP-472（及其对照物 TP-472N），用于 BRD9 和 BRD7；以及 GSK6853（及其对照物 GSK9311），用于 BRPF1B。
最后，我们将预览本系列博文的最后一篇。文章中将简要概述表观遗传学研究，并介绍化学探针在肿瘤学之外研究中的应用。